壮瑶药协同创新中心、广西壮瑶药重点实验室

目前，运用分子标记对生物体进行遗传学研究已成为诞下的重点和热点，如何在众多的分子标记中选择适当方法对遗传研究的效率和成败具有决定意义。而在众多分子标记技术中，基于SSR标记特异性的扩增、良好的稳定性及重复性、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点，被视为比较理想的遗传标记方法。特别是近年在品种鉴定、地理来源鉴别研究、居群遗传研究、有效成分与遗传多样研究等当中得到应用[1-4]。然而SSR标记具有种属特异性，不同物种间的SSR引物没有通用性，必须针对每个物种开发特异引物进行PCR检测。
拳卷地钱经生药学专家韦松基教授教授鉴定为地钱科地钱属植物拳卷地钱（Marchantia convoluta Gao et Chang），采集产地见表1。据文献报道，关于拳卷地钱生药学鉴别研究[5-8]、挥发性成分分析[9-11]、黄酮类化合物研究[12-19]、脂溶性成分研究[20,22]、抗急性肝损伤及抗乙肝病毒药理研究[22,23]及ISSR-PCR扩增体系研究[24]均见文献，但目前未见关于SSR遗传标记研究内容。本文采用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA，经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段，通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物，为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。

1. 试验材料及设备试剂

1.1材料

 药材
拳卷地钱采于广西各地，共十一个批次，具体情况见表1。



 表1 拳卷地钱样本分布

菌株
大肠杆菌(Escherichia coli) XL1
1.2 设备及试剂
PCR仪( 美国 Bio-Rad 伯乐公司,Model: PTC-200) ; DYCP-34 型电泳槽( 北京市六一仪器厂) ; CDYY -6C 型电泳仪( 北京市六一仪器厂) ; UVP 凝胶成像系统;TE缓冲液：10mM Tris.Cl，PH7.8；1.0mM EDTA，PH7.8；CTAB抽提液：2%CTAB；20mM EDTA，PH7.8；1.5M NaCl； 1.5％ PVP； 80mM Tris.C1，Ph7.8；限制性内切酶Mse I购自Biolabs公司； Pst I和TaKaRa Ex Taq酶、pMD 18-T Vector、T4 ligase购自宝生物工程(大连)有限公司； Formamide、Tris、TEMED、Boric acid、EDTA、Acrylamide、Bis-acrylamide、Urea、APS、AgNO3均购TIANGEN生物有限公司；无水乙醇、标准分子量DL2000、BSA、DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司；Binding silane、Repel silane购自索莱宝公司；所需各种接头、SSR primer 、adapter primer、suppressor primer，参照M. J. Iiayden等人的方法[25]提供序列，由大连宝生物工程有限公司合成。

2试验方法及步骤：

2.1 提取与纯化拳卷地钱基因组DNA
吸取800μl CTAB抽提液于2ml离心管，60℃水浴预热； 加入0.1g拳卷地钱叶片，200μl CTAB抽提液充分研磨后转入步骤(1)离心管中；60℃孵育2小时，15min摇匀一次； 室温8000rpm，离心6min，吸取上清液转入2ml离心管；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混合；8000rpm，离心10min，回收水相；加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，再抽提一次；吸水相，加 1/10 倍体积NaAC(5.2M)，2.5倍冰冻无水乙醇，混匀后8000rpm，离心5min；收集沉淀，75%的乙醇洗涤3遍，风干；沉淀物用去离子水溶解；加入RNAase液3μl，35℃水浴20min；水浴后，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24: l)再次抽提； 10000rpm离心5min，吸水相转新离心管；离心管冰浴，1/10体积的NaAc、2倍体积的冰冻无水乙醇加入离心管中，-20℃冰箱过夜；4℃，12000rpm离心5min，收集沉淀；75%乙醇洗2次，风干；100μl的去离子水溶解DNA，-20℃保存备用。
2.2 拳卷地钱DNA样品的酶切消化和检测
限制性内切酶酶切的反应体系：基因组DNA样品10μl；10×NEB buffer II               5.0μl；Mse I 5U；Pst I 5U；去离子水补至总体积 50μl。上述条件于36℃保温2h，随后65℃水浴保温10min，停止酶切反应，2%的琼脂糖凝胶检测酶切效果，剩余产物-20℃保存。
2.3  拳卷地钱基因组DNA样品的酶切与接头的连接
酶切效果合格后进行以下程序：
Mse I和Pst I接头退火
分别用annealing buffer溶解Mse I adapter Sense strand和Mse I adapter antisense strand；吸取等摩尔上述两种溶液加入冻存管混合，5000rpm离心10S；65℃水浴保温10min，冷却。Pst I接头退火方法同上。
        

            抑制PCR其目的是只让两端接上不同接头的双酶切产物扩增，减少SAM扩增时模板的复杂度。抑制性PCR产物呈现为清晰可见的弥散片段，大小约100-1000bp，通过抑制性PCR，达到了最终减少SAM扩增时模板的复杂度的目的，说明酶解产物与接头的连接是成功的。                         预扩增产物的扩增产物在电泳泳道内虽然仍是一片弥散状，但几条亮带隐约可见，分布己不均匀，片段大小集中于150-800左右。显然作为SAM扩增的模板，其数量己大为减少。  
DNA样品的限制性双酶切
酶切体系：基因组DNA样品20μl；Mse I 0.5μl；PSt I 0.5μl；10×NEB buffer II 5μl；BSA 0.5μl；ddH2O 50μl。混匀，离心，放入水浴箱 37℃水浴2h。
DNA酶切样品连接接头
吸取50pmol Mse I和5pmol Pst I接头加入DNA中，45℃水浴5min。随后加入：10mg/ml BSA  0.05μl、10×NEB buffer II 0.5μl、T4 1igase 0.5μl、10mM dATP 3.5μl、ddH20至60μl；5000rpm离心10S；37℃保温1h，室温放置2h。
2.4 Suppression PCR和检测
反应体系：10×EX Taq Buffer 2μl；25mM MgC12 1.5μl；己完成酶切和连接的DNA样品4μl；dNTP Mix (各2.5mM) 1.5μl；Takara ExTaq  lU；Mse I suppressor primer 5pmol；Pst I suppressor primer  5pmol；ddH2O至 20μl。5000rpm离心10S。按以下条件进行PCR扩增：94℃预变性1min；变性94℃ 1min，56℃复性 1min，72℃延伸1min， 25个循环后；72℃再延伸5min，4℃保存。

2.5  DNA样品的预扩增和检测
预扩增反应体系：Takara Ex Taq 1U；10×Ex Taq Buffer 2μl；稀释好的suppression PCR产物 1μl；25mMMgC12  1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM) 1.5μl；Mse I adapter Primer 1 5pmol；Pst I adapter primer 5pmol；ddH20至20μl。按2.4项下条件扩增。
2.6 SAM扩增
SAM扩增反应体系：10×Ex Taq Buffer 2μl；稀释好的预扩增产物 2μl；Takara Ex Taq  lU；25mM MgCl2 1.5μl；dNTP Mix(各2.5mM) 1.5μl；Mse I adapter primer 3(4~10) 5pmol；SSR primer(PCT6) 20pmol；加ddH20至20μl，然后按表2 设置PCR扩增参数。扩增产物4℃贮存备用。







表2  SAM  PCR 参数

2.7  SAM扩增产物的回收
将清晰的SAM扩增产物的条带切下，转0.5ml的离心管；加入0.2ml去离子ddH2O浸泡胶条，浸泡l min后，用移液枪吸干水分；将胶条尽量捣碎后加入50μl的无菌ddH2O浸泡1h；3000rpm，离心3min，取上清液2μl作为模板进行第二次SAM扩增，反应体系和扩增参数同第一次；回收二次SAM扩增产物。
2.8  SAM扩增产物的克隆
连接反应
根据宝生物工程(大连)有限公司生产的试剂盒的说明书，按程序将PMD 18-T Vector与PCR回收产物相连接。
感受态细胞的制备
从LB平板上用无菌牙签挑取新培养的单菌落，接种于25ml LB液体培养基中，在震荡培养箱中恒温37℃，200rpm不间断振荡培养13h；灭菌的10ml离心管中转入培养液，冰浴冷却10min； 4℃，8000rpm离心5min；去上清液，沉淀物加入10ml预冷的100mM的CaC12溶液；冰浴30min，4℃，8000rpm离心5min，去上清；用600μl预冷的100mM的CaC12溶液重悬沉淀物， 4℃保存备用。
转化
在含有100μl E.coli XL1感受态细胞1.5ml离心管中加入10μl连接反应液，混均，埋入碎冰，冰浴30min；立即放入42℃水浴箱，热激处理90S，埋入冰中1-2min；吸取400μl LB培养基转离心管，混匀，恒温培养箱37℃，200rpm震荡培养1h；无菌条件下吸取200μl转化液在LB固体平板（含100μg/ml Amp）上均匀涂布，吹干后恒温培养箱37℃培养12-16h。
重组子的菌液PCR鉴定
1ml LB液培养基(含100μg/ml Amp)的离心管，加入转化平板上单菌落，恒温培养箱37℃培养12-16h；反应体系:稀释好的预扩增产物 2μl、10×Ex Taq Buffer 2μl、dNTP Mix(各2.5mM) 1.5μl、Takara Ex Taq lU、25mM MgCl2 1.5μl、Mse I adapter primer 3(4~10) 5pmol、SSR primer(PCT6) 20pmol、无菌ddH2020μl；混匀后4500rpm离心10sec，放入PCR扩增仪，按表2 PCR参数扩增，扩增后产物1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
重组子的穿刺培养
2ml穿刺管倒如LB固体培养基(含100μg/ml Amp)，待凝固后，挑取重组子的菌液插入培养基中数次，37℃培养箱，过夜。测序由宝生物工程 (大连)有限公司完成。
2.9有用引物的筛选
根据测序结果，特异引物采用Primer Premier5.0软件设计。由上海生物工程技术服务有限公司合成。
以拳卷地钱的基因组DNA为模板，使用特异引物，建立PCR反应体系：Taq DNA Polymerase 1U、拳卷地钱的基因组DNA(100ng/μl) 2μl、10×PCR Buffer(Sangon) 2μl、25mM MgCI2 1.2μl、dNTP Mixture(各10mM) 0.4μl、Special primer 5pmol、SSR primer(PCT6) 5pmol、无菌ddH2O 20μl；混匀后5000rpm离心10S；PCR扩增，参数如表3 ，扩增产物2%琼脂糖电泳检测。
表3  PCR扩增参数

3  结果与分析

3.1  拳卷地钱的基因组DNA的提取

紫外分光光度计测定显示用改良的CTAB法提取的拳卷地钱的基因组DNA的OD 260/OD280比值在1.80左右，OD260/OD230比值大于2.0，表明纯度比较高，同时经1%琼脂糖凝胶电泳检测，提取纯化后的拳卷地钱的基因组DNA为一条清晰完整的带，没有拖带，没有可见的RNA，且亮度高。说明CTAB法提取的拳卷地钱的基因组DNA产量大（浓度高）、质量好、纯度高、相对分子量大，十分适合于后续的实验。

3.2  DNA的酶切及抑制性PCR、预扩增产物的检测

用限制性内切酶MseΙ和PstΙ 对拳卷地钱的基因组DNA进行双酶切，酶切产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测，在泳道中双酶切的DNA呈片状弥散分布，其片段大小主要集中在大约100-1500bp范围内，证明MseΙ和PstΙ双酶切体系能很好地将DNA酶解彻底。

3.3 SAM扩增结果分析

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将SAM扩增产物分离，凝胶银染结果如图1:几乎在聚丙烯酰胺凝胶板的每个泳道均有10-30条清晰的条带，大小在50-700bp之间，不同泳道的扩增条带由于是用3′端含不同选择性碱基的Mse I接头引物扩增出来的，所以各泳道间的DNA谱带都各不相同。说明拳卷地钱的基因组中含有丰富的二核苷酸CT重复。

3.4  SAM扩增产物的回收与克隆

3.4.1  SAM扩增产物的回收

随机挑选200个大小不同的SAM扩增片段，枪头压碎并用双蒸水浸泡离心，进行第二次SAM扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，DNA纯化试剂盒回收，回收的产物的2%琼脂糖凝胶电泳检测，各泳道只现出一条清晰的条带，片段大小约150bp。证明SAM扩增是成功的，且回收片段都比较纯，没有拖带、杂带。非常适合于后续的实验工作。
3.4.2  回收产物的克隆
回收产物通过与PMD 18-T Vector的连接，转入感受态细胞，经Amp+LB平板筛选得到阳性克隆，随机从每个平板上挑选2个白色菌落。经菌液PCR 检测，含有目的插入片段的重组子进行穿刺培养后寄出测序分析。总共克隆得到了100个SAM片段用于测序。

3.5特异引物的设计

拳卷地钱SSR特异引物的设计是根据测序得到的DNA片段中所含的SSR的侧翼序列采用Primer premier 5.0软件设计特异引物，有些片段含引物间二聚体、发夹结构或因侧翼序列太短而无法设计出合适的引物，从86个片段中根据SSR位点的一侧或两侧序列设计了特异引物进行合成。

3.6 有用引物的筛选

使用所设计的不同的SSR特异引物，与5´锚定兼并引物SSR primer(PCT6)组成引物对，以拳卷地钱的基因组DNA为模板，经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出30对清晰条带的特异引物。筛选结果见图2。

  
              图1 SAM扩增产物电泳图
         M:DL2000；1-9：SAM扩增PCR产物

  
图2引物电泳图                     M:DL2000；1-9：不同引物PCR扩增产物
4 小结
SSR 微卫星 DNA 标记需要建立、筛选基因组文库 、克隆测序、引物设计等一系列实验，人力、 物力消耗巨大。但随着对微卫星研究技术的深入，由于其核苷酸序列的保守性, 使得一物种的微卫星引物可能被用于近缘物种，从而有效地减少了设计 SSR 标记的繁琐操作，弥补了不足 。
本文首次利用SAM法设计了拳卷地钱的SSR引物：利用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA，经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段，连接扩增产物转化大肠杆菌，随机挑取白斑，筛选得到100个阳性克隆进行测序，得到SSR引物的86条序列。通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物30对。随着对拳卷地钱的进一步开发利用和研究，SSR 分子标记将应用于拳卷地钱的品种鉴定，遗传分析，遗传图谱建立，分类研究和种质资源鉴定等各个领域。


参考文献：
[1]刘玉林,李伟,董树斌,等. 文冠果转录组SSR特征分析及EST-SSR标记开发[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2017,45(03):89-95.
[2]王秀华,李家丽,蒲艳艳,等. 黑麦草EST-SSR分子标记开发及生物信息学分析[J]. 山东农业科学,2016,48(10):1-6.
[3]陈静,毛瑞喜,胡晓辉,等. 利用RIL群体检测与花生高油酸含量连锁的SSR标记[J]. 花生学报,2016,45(01):1-7.
[4]秦艳梅,李向,赵建军,等. 不结球白菜品种基于SSR标记的群体结构分析[J]. 华北农学报,2013,28(03):62-66.
[5]朱华,杜沛霖,周雨晴等. 广西产3种地钱叶状体的扫描电镜观察[J]. 广西中医药,2013,36(05):77-78.
[6]朱华,周春山,白燕远. 地钱原植物分类检索及紫外光谱的分析研究[J]. 中医药学刊,2003,21(10):1646-1670.
[7]朱华,杜沛霖,周雨晴,等. 广西产三种地钱RAPD分子鉴定初步研究[J]. 大众科技,2013,15(06):165-166+61.
[8]邹登峰,朱华,肖建波,等. 地钱、拳卷地钱和粗裂地钱的紫外谱线组法鉴别(英文)[J]. 天然产物研究与开发,2005,17(04):463-464.
[9]曹慧,肖建波,周春山,等. 拳卷地钱不同提取部位的气相色谱-质谱分析比较和部分生物活性研究[J]. 质谱学报,2005,26(01):1-5.
[10]肖建波,周春山,曹慧. 拳卷地钱挥发油的CO_2超临界流体萃取及GC-MS分析[J]. 中药新药与临床药理,2005,16(03):191-194.
[11]曹慧,蒋新宇,肖建波. 拳卷地钱挥发油成分分析[J]. 广西植物,2005,25(06):596-597.
[12]朱华,邹登峰,肖建波,等. 拳卷地钱总黄酮的提取与纯化[J]. 食品科学,2005,26(10):156-159.
[13]肖建波,曹慧,向海艳,等. 拳卷地钱中黄酮类化合物的含量测定(英文)[J]. 天然产物研究与开发,2005,17(02):186-189+194.
[14]曹慧,肖建波,周春山,等. 拳卷地钱中黄酮类化合物的含量测定[J]. 中南药学,2005,03(01):7-9.
[15]童星,陈晓青,蒋新宇,等. 微波法和法多索法提取拳卷地钱中总黄酮的研究[J]. 中成药,2008,30(04):625-627.
[16]朱华. 拳卷地钱中黄酮类化合物的分离纯化、结构表征及生物活性研究[D].中南大学,2004.
[17]朱华,邹登峰,黄海滨,等. 拳卷地钱中芹菜素的测定[J]. 化工技术与开发,2005,34(02):30-32+43.
[18]朱华,肖建波,邹登峰,等. 硅胶柱色谱/RP-HPLC/LC-ESI-MS分离纯化鉴定拳卷地钱中芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甙(英文)[J]. 天然产物研究与开发,2005,11(01):38-41.
[19]朱华,肖建波,邹登峰,等. 硅胶柱色谱/RP-HPLC/LC-ESI-MS分离纯化鉴定拳卷地钱中芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷[J]. 中医药学刊,2005,18(01):20-22.
[20]肖建波. 拳卷地钱中脂溶性成分的分离纯化、结构表征及生物活性研究[D].中南大学,2005.
[21]朱华,周春山,黄海滨,等. 拳卷地钱脂溶性部分化学成分研究[J]. 广西植物,2003,23(06):571-572.
[22]王跃峰,张可锋,周雨晴,等. 拳卷地钱总黄酮对四氯化碳致急性肝损伤大鼠的保护作用及其作用机制[J]. 时珍国医国药,2017,28(02):277-279.
[23]朱华,梁东艳,笪舫芳. 拳卷地钱总黄酮提取物抗乙型肝炎病毒体外实验研究[J]. 大众科技,2013,15(04):110-111+99.
[24]周雨晴,杜沛霖,王跃峰,等. 拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化[J]. 时珍国医国药,2014,25(06):1498-1500.
    [25] M J Hayden,P J Sharp. Targeted development of informative microsatellite(SSR) markers. Nucleic Acids Research,2001,29(8):44-49