不同产地的锡叶藤叶子中黄酮类成分的含量测定及对比分析

黄文秀

（广西医科大学，广西南宁，530021）
 
目的：对不同产地的壮药锡叶藤叶中黄酮类成分进行含量测定以及对比分析，为其药材的质量控制提供依据.方法：采用水浴回流提取锡叶藤叶中黄酮类化合物，利用紫外分光光度计测定锡叶藤叶中总黄酮含量。结果:发现不同产地的锡叶藤总黄酮的含量有差异，其中以高峰（19.41%）的含量最高，其次是广东惠州（16.88%）、香港（16.76%），以广西博白上村塘（3.91%）总黄酮含量最低，其次是广西北流(4.15%)，样品总黄酮含量范围在3.91%~19.41%,平均含量约为12.36%。结论:紫外分光光度法操作便捷，重复性好，检测结果准确、可信度高，可用于锡叶藤中黄酮类成分的含量测定。
关键词：锡叶藤；总黄酮；产地含测
 
The content determination and comparative analysis of flavonoids in the leaves of Tetracera asiatica from different habitats
HUANG Wenxiu
 (Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi,530021,China)
 
Objective: to determine and compare the content of flavonoids in the leaves of Tetracera asiatica from different areas, so as to provide a basis for the quality control of the medicinal materials. Results: the content of total flavonoids in different regions of Tetracera asiatica, found that there are differences between the content of total flavonoids of Tetracera asiatica different regions, of which peak (19.41%) of the highest levels, followed by huizhou (16.88%), Hong Kong (16.76%), above the village pond (3.91%) of total flavonoids content is the lowest, followed by the north flow (4.15%), the sample range of flavonoids content in 3.91% ~ 19.41%, the average content of about 12.36%. Conclusion: uv spectrophotometry is simple, reproducible, accurate and reliable, and can be used for the determination of flavonoids in Tetracera asiatica.
  Key words：Tetracera asiatica；total  flavonoids; Including measurement of origin
 
引  言
锡叶藤来源于植物为五桠果科植物,锡叶藤Tetracera asiatica (Lour.) Hoogland,始载于《常用中草药手册》^[1],别名涩藤、雪藤、糙米藤、勾牙叶、狗舌藤等。锡叶藤其属于四季常绿的植物，一般可长达20米或者更长，大多有分支相互缠绕，枝条粗糙，其叶子常常被毛，极其粗糙。锡叶藤全年都可以采收，洗净，阴干后，即可药用。其药用部位常常为根以及茎叶。其主治长时间腹泻、脱肛、便后出血、男性遗精、女性白带、子宫脱垂、跌打肿痛、肝脾肿大、便秘等^[2]。锡叶藤主要生长于低海拔的山地、丛林、灌木丛、等。并且集中分布于广西、广东、云南、香港、海南等热带及亚热带地区^[3]。锡叶藤为广西壮族民间常用的药材,大量分布于广西南部地区,植物资源丰富,开发潜力很大。据《中华本草》^[4]记载锡叶藤来源为五桠果科植物锡叶藤和毛叶锡叶藤的根茎叶,《壮药材锡叶藤、兰香草、大叶金花草、耳草的研究》^[5]中记载锡叶藤源于锡叶藤的根、茎及叶；《中药大辞典》^[6]中论述了锡叶藤药用为根或茎叶,《壮药药材学》^[2]记载锡叶藤药用部位为根及茎叶。其药材中富含鞣质、黄酮类、萜类类物质等多种生物活性成分。其中对该药物叶广西各产地类黄酮类测定几乎没有,并且叶子易于采集,有效利用叶子,能够很好的保护药用资源。为此采集了的样品来自于广西东兴、上思、武鸣、横县、广东惠州、香港等十多个产地,为锡叶藤药材资源的可持续利用提供科学依据以及数据支持。
目前，国内外对锡叶藤的研究并不多，大部分文献来源其科属植物的研究，我国国内对锡叶藤的研究主要集中在药物化学成分分析的领域较多，然而国外主要在药理作用以及资源管理的方面较多，目前国外对锡叶藤的研究成果胜于我国国内对锡叶藤的研究。本次试验以锡叶藤的叶为研究对象,利用紫外分光光度计,对广西、广东、香港等不同产地的锡叶藤的叶中黄酮类成分进行含量测定研究,为壮医使用锡叶藤提供实验数据支撑。实验数据良好,可行性高,可以为锡叶藤药材以后的资源的可持续利用提供科学的依据以及数据支持。
实验材料
1.1药材
锡叶藤药材分别采于广西不同地区，经广西中医药大学滕建北副教授鉴定为五桠果科植物锡叶藤Tetracera asiatica (Lour.)Hoogl. 的叶。样品低温干燥后，粉碎成粗粉，备用。
1.2仪器
UV2600紫外-可见分光光度计（Agilent公司）；B35005-MT超声清洗仪（上海必能信公司）；电子分析天平(赛多利斯仪器（北京）有限公司)；HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗器械厂）；粉碎机等。
1.3试剂
芦丁对照品（中国药品生物制品检验所，批号ZX63-UTXV，供含量检测使用）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、乙醇均为分析纯，水为纯净水。
实验方法与结果
2.1锡叶藤中总黄酮的含量测定
2.1.1对照品溶液的制备
采用电子分析天平对干燥后的对照芦丁粉末进行精确称量，称量5mg,将称好的芦丁粉末放置于25ml干燥的锥形瓶中，随后用移液管移取10ml50%乙醇，进行超声溶解。放冷静置，最后加入50%乙醇至刻度线处，上下轻轻翻转,摇匀,即可得到芦丁对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备
取锡叶藤叶样品(容县底金村)粗粉末各1g,用万分之一的电子分析天平精密称量,将样品粉末放置于150ml的锥形瓶中,用移液管移入50%乙醇25mL,带瓶塞称重,记录下总重量。采用70℃水温的水浴回流装置回流提取1次,提取时间1h。放冷静置,用滴管加入50%乙醇至锥形瓶，以补足至之前记录的重量。用5ml的移液管精密移取滤液3mL置于25mL干燥的容量瓶中,并用滴管加入50%乙醇至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,即可得到锡叶藤样品溶液。
2.1.3 测定波长的选择
取用芦丁对照品溶液及锡叶藤供试品溶液各1mL,移入于10mL干燥的量瓶中,用1ml的移液管移取5%NaNO2溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO3)3溶液0.5mL,上下轻轻翻转摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min,选用50%乙醇作参比溶液。按照紫外-可见分光光度法^[16](《中国药典》2015版一部附录VA),选用波长为200~800nm处扫描,结果显示在501nm有最大吸收波长,故选501nm为本次实验的测定波长。
2.1.4方法学考察
2.1.4.1线性关系的考察
用移液枪精密移取上述制备的芦丁对照品溶液0mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL分别置于10mL容量瓶中,用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,用移液管移取10%Al(NO₃）₃溶液0.5mL,摇匀,放置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,放置10min,用50%乙醇作空白对照溶液，测出波长503nm处测定不同浓度芦丁的吸光度,平行测试3次,即得芦丁对照品溶液的校准曲线。采用最小二乘法进行回归计算,即可得到吸光度值(Y)与芦丁标准溶液的溶度(X)的关系曲线:Y=11.813x-0.001，相关系数为 R²=0.9999。结果显示,芦丁标准溶液在(0.004-0.12)mg/ml浓度范围内与吸光度线性关系良好,结果见表4-1,见图1-2。
表4-1  芦丁标准曲线测定结果

标准溶液浓度C（mg·mL-1）	0.004052	0.02026	0.04052	0.08104	0.12156
吸光度A	0.05112	0.22375	0.45015	0.91369	1.37357

 
 
图1-2  标准曲线图
2.1.4.2 精密度试验
用移液枪移取上述芦丁对照品溶液1.0mL，用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO₃)₃溶液0.5mL,上下轻轻翻转摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min后，并连续测定6次吸光度,结果表明本次试验方法精密度良好,可信度高,可达到含量测定的标准。见表4-2。
表4-2 精密度试验结果表

编号            吸光度（A）	平均吸光度（A）	RSD（%）
1              0.45252   2              0.45256 3              0.45261 4              0.45229 5              0.45232 6              0.45230	0.45243	0.03

2.1.4.3 稳定性试验
用移液枪移取锡叶藤叶样品(容县底金村)供试品溶液1.0mL,用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO₃)₃溶液0.5mL,上下轻轻翻转摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min后，在室温下放置0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min,测定吸光度。实验结果显示:显色后70 min内稳定性好，可满足实验检测要求。见表4-3。
表4-3  稳定性试验结果表

时间（min）	吸光度（A）		平均吸光度（A）	RSD(%)
0 10 20 30 40 50 60 70 80	0.59159 0.56799 0.55829 0.55212 0.53716 0.53094 0.52541 0.51302 0.50393		0.54227	4.66

2.1.4.4 重复性实验
取锡叶藤叶(容县底金村)粉末各6份,每份约1g粉末,用万分之一的电子分析天平精密称量,将样品粉末放置于150ml的锥形瓶中,用移液管移入50%乙醇25mL,带瓶塞称重,记录下总重量。采用70℃水温的水浴回流装置回流提取1次,提取时间1h。放冷静置,用滴管加入50%乙醇至锥形瓶，以补足至之前记录的重量。用5ml的移液管精密移取滤液3mL置于25mL干燥的容量瓶中,并用滴管加入50%乙醇至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,平行制备6份涩叶藤样品溶液,用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO₃)₃溶液0.5mL,上下轻轻翻转摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min后，采用紫外分光光度计下测定样品溶液的吸光度,最后计算样品溶液中总黄酮的含量。见表4-4。
表4-4  重复性试验结果表

含量(%)		平均含量(%)	RSD（%）
1 2 3 4 5 6	10.16 9.9 10.32 10.50 10.23 10.11	10.21	1.99

2.1.4.5 加样回收试验
   取上述已知含量的锡叶藤叶(容县底金村)提取液6份,每份约1g,用万分之一的电子分析天平精密称量,分别加入一定量的芦丁对照品,将样品粉末放置于150ml的锥形瓶中,用移液管移入50%乙醇25mL,带瓶塞称重,记录下总重量。采用70℃水温的水浴回流装置回流提取1次,提取时间1h。放冷静置,用滴管加入50%乙醇至锥形瓶，以补足至之前记录的重量。用5ml的移液管精密移取滤液3mL置于25mL干燥的容量瓶中,并用滴管加入50%乙醇至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,取1mL已知含量的样品供试液，用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO₃)₃溶液0.5mL,上下轻轻翻转摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min后，测定各份样品中总黄酮含量。见表4-5。
表4-5  锡叶藤茎药材加样回收率结果

称样量  /g	样品中含量/mg	加入量/mg	测得量/mg	回收率    /%	平均回收率    /%	RSD      /%
1.0004	0.49028	0.39223	0.08926	102.08	99.96	2.26
1.0001	0.49013	0.39183	0.08805	99.72
1.0006	0.49037	0.49029	0.09634	96.49
1.0005	0.49033	0.49029	0.09862	101.15
1.0001	0.49013	0.58795	0.010693	98.22
1.0003	0.49023	0.58835	0.010887	102.08

 
2.1.5 最佳提取工艺
取涩叶藤叶样品粉末各1g,用万分之一的电子分析天平精密称定,放置于150ml的干燥锥形瓶中,用移液管移入60%乙醇30mL，并带瓶塞称重,记录下重量。采用90℃水温的水浴回流装置来提取1次,提取时间1h。放冷静置,加入60%乙醇补足至之前的重量。用移液管精密量取滤液3mL放置于25mL容量瓶中,加60%乙醇至刻度,上下轻轻翻转，摇匀,即得锡叶藤样品溶液。用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO₃)₃溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min后，再用紫外分光光度计对样品供试液进行含量测定,最后计算出各产地的总黄酮含量。
 2.1.6不同产地锡叶藤叶药材总黄酮含量的测定
取各产地锡叶藤叶样品,用万分之一的电子分析天平精密称定,将样品粉末放置于150ml的锥形瓶中,用移液管移入60%乙醇30mL,带瓶塞称重,记录下总重量。采用90℃水温的水浴回流装置回流提取1次,提取时间1h。放冷静置,用滴管加入60%乙醇至锥形瓶，以补足至之前记录的重量。用5ml的移液管精密移取滤液3mL置于25mL干燥的容量瓶中,并用滴管加入60%乙醇至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,用移液枪移取1mL供试液测定各供试液溶液吸光度,用1ml的移液管移取5%NaNO₂溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min后,接着用移液管移取10%Al(NO₃)₃溶液0.5mL,上下轻轻翻转，摇匀,静置5min,再用移液管移取4%NaOH溶液5mL,最后用滴管加入50%乙醇溶液至刻度线处,上下轻轻翻转,摇匀,静置10min后，利用紫外分光光度计测吸光度。并求得样品总黄酮含量的平均值。结果表明锡叶藤药材叶样品总黄酮含量为12.36%。见表4-6。
表4-6     不同产地锡叶藤叶药材总黄酮含量(n=3)

产地	含量%	RSD%
容县底金村	10.80	0.24
仙葫	8.57	0.02
北流	4.15	2.06
灵山	10.18	0.35
上思	11.00	0.15
容县白良镇	13.98	0.10
高峰	19.41	1.80
博白县	14.94	0.08
小高峰	12.28	1.22
横县	12.94	0.15
惠州	16.88	0.32
博白县上村塘	3.91	0.67
香港	16.76	2.49
钦北区	14.63	0.74
防城港	15.18	2.35
横县2017	15.08	1.60
上思7	15.56	2.26
博白县4	5.79	2.75

 
3.小结
通过本次实验发现不同产地的锡叶藤总黄酮的含量有差异,其中以广西高峰(19.41%)的含量最高,其次是广东惠州(16.88%)、香港(16.76%),其中是上村塘(3.91%)的总黄酮含量最低,其次是北流(4.15%),样品中总黄酮含量范围在3.91%~19.41%,平均含量约为12.36%。由上述的实验结果显示，我国南部的锡叶藤叶中总黄酮含量含量差异较大，如若要取用锡叶藤的叶为原材料，建议去广西南宁高峰、广东惠州以及香港取材，而不建议去广西博白县上村塘以及广西北流取材。综合上述：不同产地的土质质量以及海拔高度,气候环境温度以及湿度、光照强度都有可能影响锡叶藤叶中总黄酮的含量，这些种种影响因素都有待进一步考察。
在实验过程中，当水浴锅中水的温度过高时，容易产生大量水蒸气，导致提取液出现倒吸的现象，这是本次实验会经常出现的一个问题。其次的问题是：锡叶藤也广泛分布于云南和海南等地，本次实验没有采集云南和海南的实验材料，缺乏相关的实验数据，是本次实验中的不足之处。本实验建立了壮药锡叶藤中黄酮类成分芦丁的含量检测方法,并对该方法进行了相关的核实验证,其中包括验证内容有线性范围、锡叶藤精密度、稳定性、重复性以及加标回收试验,结果显示该方法操作便捷、重复性好,检测结果精确、可信度高,可用于锡叶藤叶中黄酮类成分的含量测定。
 
参考文献
[1] 广西壮族自治区食品药品监督管理局.壮药质量标准第二卷（ 2011 版） [S].南宁:广西科技出版社,2011:307-308.
[2] 朱华,韦松基编.壮药药材学[M].南宁:广西民族出版社.2006:118.
[3] 广州部队后勤部卫生部编,常用中草药手册[M].北京:人民卫生出版社,1969,第一版:262.
[4] 朱华,田慧,蔡毅主编.壮药学[M].南宁:广西科学技术出版社.2015.125-127.
[5] 朱华,傅鹏主编.壮药材锡叶藤、兰香草、大叶金花草、耳草的研究[M].南宁:广西科学技术出版社.2016.204-206. 
[6] 江苏新医学编.中药大辞典下[M].上海:上海人民出版社,1977:5203.