广西产拳卷地钱药材质量评价研究

发布时间：2020-05-03 17:52:00 浏览次数：次【字体：小大】

广西产拳卷地钱药材质量评价研究

张淼李鹏谢凤凤何瑞婷
（广西中医药大学，广西南宁 530200）
拳卷地钱的研究主要集中在药理药效^[¹^]、资源调查^[²^]、分子生药学研究^[³^-⁴^]及限量检查^[⁵^]等方面，对其质量鉴别的研究较少，本课题组前期对拳卷地钱进行了生药学初步的研究，并发现拳卷地钱中保肝护肝的主要有效成分是总黄酮，本章主要从总黄酮及黄酮类成分芹菜素的含量测定等方面对广西产拳卷地钱进行质量评价研究^[⁶^]。

1 总黄酮的含量测定

1.1 仪器、试剂与药材

电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号:DHG-9240A）；玻璃仪器干燥器（郑州长城科工贸有限公司，型号：BKH-B）；万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司，型号：DFY-300C）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：SQP）；纯水仪（美国密理博 Milli-Q Advantage A10 超纯水系统）；移液器（吉尔森P型移液器）；药典筛子；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500E）；高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：H1650-W）；紫外-可见分光光度计（岛津仪器有限公司，型号：UV-2600）。
乙醇、三乙胺（均为国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。
芹菜素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111901-201603，含量为99.2%）。
实验用药材均为野生采自广西境内的25个市、区（县），经广西中医药大学韦松基教授鉴定为地钱科地钱属植物拳卷地钱(Marchantia convoiuta Gao et Chang)全草。药品采集后烘干，打粉，备用。样品采集详细信息见表1-1，采样地理分布如图1-1。

表1-1 广西产拳卷地钱采集情况表

编号	采集时间	调查地点	经纬度	海拔（m）
QJDQ-1	2018.5	南宁市兴宁区	N23°0′, E108°40′	81
QJDQ-2	2018.5	桂林市阳朔县	N24°46, E110°29′	192
QJDQ-3	2018.5	南宁市宾阳县	N23°10′, E108°38′	227
QJDQ-4	2018.5	贵港市平南县	N23°32′, E110°22′	41
QJDQ-5	2018.5	来宾市金秀县	N24°08′, E110°10′	783
QJDQ-6	2018.5	百色市靖西县	N22°57′, E106°42′	264
QJDQ-7	2018.5	桂林市平乐县	N24°46′, E110°41′	118
QJDQ-8	2018.5	河池市环江县	N24°49′, E108°14′5	209
QJDQ-9	2018.5	南宁市马山县	N23°42′, E108°10′	253
QJDQ-10	2018.5	河池市都安县	N24°21′, E108°0′	417
QJDQ-11	2018.5	贺州市昭平县	N23°52′, E111°02′	54
QJDQ-12	2018.5	钦州市浦北县	N22°01′, E109°19′	73
QJDQ-13	2018.5	河池市大化县	N23°44′, E108°0′	177
QJDQ-14	2018.5	南宁市武鸣区	N23°05′, E108°17′	121
QJDQ-15	2018.5	贵港市桂平市	N23°29′, E110°0′	121
QJDQ-16	2018.5	桂平市西山镇	N23°24′, E110°04′	51
QJDQ-17	2018.5	梧州市藤县	N23°22′, E110°54′	199
QJDQ-18	2018.5	梧州市苍梧县	N23°50′, E111°32′	44
QJDQ-19	2018.5	南宁市五塘镇	N22°56′, E108°32′	78
QJDQ-20	2018.5	玉林市容县	N22°51′, E110°33′	76
QJDQ-21	2018.5	崇左市大新县	N22°49′, E107°11′	254
QJDQ-22	2018.6	百色市田阳县	N23°44′, E106°54′	112
QJDQ-23	2018.6	梧州市蒙山县	N23°28′, E111°19′	156
QJDQ-24	2018.6	贺州市平桂区	N24°27′, E111°28′	163
QJDQ-25	2018.6	贺州市八步区	N24°24′, E111°33′	109

图1-1 广西产拳卷地钱采样分布图

1.2 方法与结果

1.2.1 对照品溶液的制备
精密称取芹菜素对照品0.598 mg，80%乙醇定容至50 mL容量瓶中，即得芹菜素对照品溶液，备用。
1.2.2 供试品溶液的制备
称取药材粉末2.0 g，精密称定，加80%乙醇溶液50 mL，称定重量，超声提取60 min，冷却至室温，补重，过滤，取续滤液，即得。

1.2.3 显色方法筛选

分别取供“1.2.1”、“1.2.2”项下方法制备的对照品溶液与供试品溶液各1 mL，分别采用硝酸铝显色法（按Al(NO₃)₃-Na₂NO₂-NaOH方法反应，加80%乙醇溶液定容至25 mL棕色容量瓶）和1%三乙胺-80%乙醇溶液显色法（加3 mL 1%三乙胺，加80%乙醇溶液定容至10 mL棕色容量瓶），运用紫外可见分光光度法进行全波长扫描。见图1-2、1-3。

a b
图1-2硝酸铝显色法紫外光谱图
（a-芹菜素对照品溶液光谱图；b-拳卷地钱供试品溶液光谱图）

a b
图1-3 三乙胺-80%乙醇溶液显色法紫外光谱图
（a-芹菜素对照品溶液光谱图 b-拳卷地钱供试品溶液光谱图）
结果显示，硝酸铝显色法供试品溶液无最大吸收波长，1%三乙胺-80%乙醇溶液显色法显色良好，故显色方法选择1%三乙胺-80%乙醇溶液显色法。

1.2.4 最大吸收波长的选择

分别取对照品溶液1 mL，供试品溶液1 mL，分加入1%三乙胺溶液3 mL，加80%乙醇溶液定容至10 mL棕色容量瓶，摇匀，紫外全波长扫描，确定最大吸收波长396 nm。见图1-4。

A：对照品溶液紫外光谱图 B：供试品溶液紫外光谱图
图1-4 紫外全波长扫描图

1.2.5线性关系考察

分别精密量取对照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL容量瓶中，加1%三乙胺溶液3 mL，80%乙醇溶液定容至刻度线，采用紫外分光光度计在396 nm处测定其吸光度值，结果见表1-2，图1-5。以对照品溶液的吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算得到回归方程为：Y=9.78492X +0.00261625（R²=0.99935），表明芹菜素在0.01196～0.07176 mg/mL 范围内呈良好线性关系。见表1-2。

表1-2 芹菜素标准溶液测定结果

编号	1	2	3	4	5	6	7
浓度（mg/ml）	0	0.01196	0.02392	0.03588	0.04784	0.0598	0.07176
吸光度（A）	0	0.07404	0.22591	0.36004	0.47464	0.58388	0.70457

图1-5 芹菜素标准曲线与回归方程

1.2.6 方法学考察

1.2.6.1 精密度试验
取对照品溶液适量，按“1.2.3”项下显色方法，紫外分光光度计396 nm处测定吸光度。连续测定6次，记录吸光度值，计算总黄酮含量。RSD=1.84%（n=6），表明该仪器精密度良好。见表1-3。
表1-3 精密度试验结果

次数	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD（%）
吸光度（A）	0.2258	0.2259	0.2257	0.2332	0.2334	0.2339	0.2297	1.84

1.2.6.2 稳定性试验
精密称取QJDQ-12号药材粉末2 g，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下显色方法，于UV 396 nm波长处测定，分别放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h后进行样品测定，记录吸光度值，计算总黄酮含量。RSD=2.59%（n=6），表明拳卷地钱供试品溶液显色在24 h内稳定。见表1-4。
表1-4 稳定性试验结果

时间	0	2h	4h	8h	12h	18h	24h	平均值	RSD（%）
含量(mg/g)	4.9741	4.8284	4.6573	4.7033	4.6649	4.6240	4.7250	4.7396	2.59%

1.2.6.3 重复性试验
精密称取QJDQ-12号药材粉末2 g，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，按“1.2.3”项下显色方法，于UV 396 nm处测定吸光度，记录吸光度值，计算总黄酮含量。RSD=2.43%（n=6），表明本方法的重复性良好，结果见表1-5。

表1-5 重复性试验结果

序号	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD（%）
含量(mg/g)	4.8614	4.7263	4.8175	4.7095	4.5627	4.6142	4.7153	2.43%

1.2.6.4 加样回收试验
精密称取已知总黄酮含量的样品QJDQ-12号药材粉末1 g（总量的一半），平行取8份，精密称定，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，并每份加入1 mL浓度为2.3568 mg/mL的芹菜素对照品，按“1.2.3”项下显色方法，于UV 396 nm处测定吸光度，记录吸光度值，计算含量。平均回收率为101.14%，RSD=2.92%（n=8），表明本方法误差小，准确度较好。见表1-6。

表1-6 加样回收试验结果

序号	样品总黄酮的量（mg）	测得量（mg）	回收率（%）	平均回收率（%）	RSD（%）
1	2.3584	4.7433	101.19	101.14	2.92
2	2.3579	4.7322	100.74
3	2.3582	4.6001	95.13
4	2.3572	4.8119	104.15
5	2.3575	4.7723	102.46
6	2.3584	4.7334	100.77
7	2.3586	4.8265	104.71
8	2.3579	4.7131	99.93

1.3拳卷地钱总黄酮含量测定
称取不同批次的拳卷地钱药材粉末，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下显色方法，采用紫外分光光度法于396 nm处测定吸光度，记录吸光度值，分别代入标准曲线方程计算拳卷地钱中总黄酮含量，其含量范围为4.6822~26.3007 mg/g，结果见表1-7。

表1-7 广西产拳卷地钱中总黄酮含量

编号	总黄酮含量（mg/g）	平均含量（mg/g）	RSD（%）
QJDQ-1	12.5249	12.5249	0.10
	12.5122
	12.5376
QJDQ-2	5.8521	5.8577	0.08
	5.8605
	5.8605
QJDQ-3	14.9491	14.9857	0.21
	14.9998
	15.0082
QJDQ-4	6.4476	6.4542	0.21
	6.4448
	6.4701
QJDQ-5	23.5562	23.5585	0.01
	23.5590
	23.5604
QJDQ-6	23.0649	23.1958	0.65
	23.1634
	23.3591
QJDQ-7	6.8502	6.8352	0.19
	6.8263
	6.8291
QJDQ-8	23.9855	23.8828	0.70
	23.6885
	23.9743
QJDQ-9	18.1208	18.1344	0.09
	18.1517
	18.1306
QJDQ-10	15.6642	15.6661	0.01
	15.6684
	15.6656
QJDQ-11	26.3107	26.3007	0.02
	26.3007
	26.2907
QJDQ-12	4.6794	4.6822	0.13
	4.6893
	4.6780
QJDQ-13	12.1251	12.1270	0.02
	12.1265
	12.1293
QJDQ-14	16.9383	17.0105	0.37
	17.0509
	17.0424
QJDQ-15	6.4476	6.4542	0.21
	6.4448
	6.4701
QJDQ-16	9.2772	9.2617	0.15
	9.2561
	9.2518
QJDQ-17	12.8797	12.8956	0.23
	12.9303
	12.8768
QJDQ-18	9.8135	9.8182	0.04
	9.8220
	9.8192
QJDQ-19	24.2460	24.3239	0.52
	24.4712
	24.2544
QJDQ-20	13.6553	13.6497	0.18
	13.6230
	13.6708
QJDQ-21	13.1288	13.1232	0.05
	13.1162
	13.1246
QJDQ-22	15.6896	15.6966	0.04
	15.7008
	15.6994
QJDQ-23	8.4987	8.4992	0.04
	8.4959
	8.5029
QJDQ-24	22.1456	22.3600	1.03
	22.3328
	22.6017
QJDQ-25	14.2142	14.1983	0.10
	14.1847
	14.1960

1.4 小结

本实验以芹菜素为对照品，采用紫外可见分光光度法于396 nm波长下测定其吸光度值。芹菜素溶液浓度在0.01196 mg/mL~ 0.07176 mg/mL范围内线性关系良好，平均加样回收率为101.14%；测得25批次拳卷地钱药材中总黄酮的含量在4.6822~26.3007 mg/g范围内。总黄酮含量最高的产地是广西贺州市昭平县。本研究建立了广西产拳卷地钱中总黄酮的含量测定方法，该方法简单、准确、可靠、便捷，具有良好的重复性和稳定性，可作为测定拳卷地钱总黄酮含量的方法。

2 芹菜素的含量测定

2.1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪、G1315B型紫外检测器；电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：SQP）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（美国密理博 Milli-Q Advantage A10 超纯水系统）；移液器（吉尔森P型移液器）。
乙腈、甲醇(色谱纯，Fisher公司)，磷酸(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)。
芹菜素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111901-201603，含量为99.2%）。
实验用药材来源及采集情况见上表1-1。

2.2 实验方法与结果

2.2.1 溶液的制备

2.2.1.1 对照品溶液制备
精密称定芹菜素对照品5.14 mg，甲醇容至50 mL棕色容量瓶中，配制芹菜素对照品溶液，备用。
2.2.1.2 供试品溶液制备
称取拳卷地钱药材粉末1.0 g，精密称定，加甲醇溶液25 mL，称重，超声提取1 h后，补重，取续滤液，置离心机中13000 r/min离心10 min，吸取上清液5 µL，备用。

2.2.2 色谱方法

色谱柱：UltimatRXB-C₁₈（4.6×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.4％磷酸水溶液（34:66）；进样量：10 µL；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm（未加入1%三乙胺显色反应，检测波长为330 nm）；柱温：25℃。柱效以芹菜素计算，理论塔板数不少于4500。

2.2.3 系统性适应性试验和专属性实验

分别取“2.2.1.1”项下对照品溶液、“2.2.1.2”项下供试品溶液和甲醇溶液，按“2.2.2”项下色谱条件测定，结果见图1-6。

图1-6 色谱测定图
（A：芹菜素色谱图；B：拳卷地钱样品色谱图；C：空白对照色谱图；a：芹菜素的色谱峰）

2.2.4 标准曲线制备

分别量取“2.2.1.1”项下芹菜素对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，微孔滤膜过滤，按“2.2.2”项下色谱条件测定。以峰面积为纵坐标（Y）浓度为横坐标（X），得芹菜素的回归方程Y=55252.61148 X+8.4310515（R²=0.99976），线性范围为0.0041~0.0246 mg/mL。见表1-8，图1-7。

表1-8 芹菜素线性范围考察实验结果表

序号	1	2	3	4	5	6
浓度（mg·ml^-1）	0.0041	0.0082	0.0123	0.0164	0.0206	0.0246
峰面积（A）	245.2	467.6	689.0	908.7	1130.4	1381.0

图1-7 芹菜素标准曲线和回归方程

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 精密度试验
精密吸取按“2.2.1.1”项下制备对照品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件连续测定6次。测得芹菜素对照品的RSD=0.44％，表明仪器精密度良好。见表1-9。

表1-9 精密度试验结果表

编号	峰面积(A)	平均值(A)	RSD（%）
1	223.5	225.18	0.44
2	224.7
3	225.9
4	225.1
5	226.1
6	225.8

2.2.5.2 稳定性试验
精密称定拳卷地钱药材QJDQ-18号粉末1 g，按按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h测定。测得芹菜素的RSD=2.49％，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。见表1-10。

编号	芹菜素含量（mg）	平均值（mg）	RSD（%）
1	0.1158	0.1106	2.49
2	0.1102
3	0.1105
4	0.1101
5	0.1080
6	0.1088

表1-10 芹菜素稳定性试验结果表

2.2.5.3 重复性试验
精密称定拳卷地钱药材QJDQ-18号粉末1 g，按按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定。测得拳卷地钱中芹菜素峰面积的RSD=2.61%，表明试验重复性良好。见表1-11。

表1-11 芹菜素重复性试验结果表

编号	芹菜素含量（mg）	平均值（mg）	RSD（%）
1	0.1172	0.1126	2.61
2	0.1102
3	0.1150
4	0.1124
5	0.1098
6	0.1110

2.2.5.4 加样回收试验
精密称定拳卷地钱药材QJDQ-18号粉末0.5 g（已测1 g药材芹菜素含量0.1088 mg），平行取6份，按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密加入1 mL浓度为0.0538 mg/mL的芹菜素对照品，按“2.2.1.2”项下方法制备溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率。
表1-12 芹菜素加样回收率试验结果表

编号	样品芹菜素的量（mg）	加入标准品的量（mg）	测得量（mg）	回收率（%）	平均回收率（%）	RSD（%）
1	0.0544	0.0538	0.1083	100.19	101.09	2.97
2	0.0543	0.0538	0.1086	100.74
3	0.0545	0.0538	0.1059	95.73
4	0.0542	0.0538	0.1104	104.15
5	0.0543	0.0538	0.1095	102.46
6	0.0544	0.0538	0.1087	100.77
7	0.0541	0.0538	0.1108	104.71
8	0.0545	0.2080	0.1082	99.93

测得芹菜素平均加样回收率=101.09%，RSD=2.97%。见上表1-12。
2.2.6 芹菜素含量测定
取25批次的拳卷地钱药材1.0 g，按“2.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定，记录芹菜素的峰面积，分别代入标准工作曲线方程计算样品中芹菜素的含量在0.0344~0.7572 mg/g范围内，结果见表1-13。

表1-13 各批次药材芹菜素的含量

编号	芹菜素的含量（mg/g）	芹菜素的平均含量（mg/g）	RSD（%）
QJDQ-1	0.3424	0.3419	0.16
	0.3420
	0.3413
QJDQ-2	0.0599	0.0596	0.50
	0.0596
	0.0593
QJDQ-3	0.3523	0.3602	2.76
	0.3714
	0.3570
QJDQ-4	0.2631	0.2651	1.46
	0.2627
	0.2696
QJDQ-5	0.1330	0.1336	0.48
	0.1335
	0.1343
QJDQ-6	0.0436	0.0442	1.84
	0.0438
	0.0451
QJDQ-7	0.1405	0.1420	1.10
	0.1436
	0.1418
QJDQ-8	0.3573	0.3647	2.41
	0.3744
	0.3624
QJDQ-9	0.4504	0.4527	0.45
	0.4533
	0.4543
QJDQ-10	0.1995	0.2016	1.07
	0.2015
	0.2038
QJDQ-11	0.7559	0.7572	0.18
	0.7572
	0.7586
QJDQ-12	0.0351	0.0344	2.58
	0.0334
	0.0347
QJDQ-13	0.1989	0.2001	0.68
	0.1999
	0.2016
QJDQ-14	0.2664	0.2658	0.21
	0.2655
	0.2654
QJDQ-15	0.1031	0.1031	0.24
	0.1034
	0.1029
QJDQ-16	0.2676	0.2684	0.70
	0.2671
	0.2706
QJDQ-17	0.0440	0.0438	1.34
	0.0431
	0.0442
QJDQ-18	0.1045	0.1045	1.10
	0.1057
	0.1034
QJDQ-19	0.2146	0.2139	0.28
	0.2136
	0.2135
QJDQ-20	0.1981	0.1982	0.25
	0.1978
	0.1987
QJDQ-21	0.1809	0.1811	0.08
	0.1811
	0.1812
QJDQ-22	0.0483	0.0487	0.72
	0.0487
	0.0490
QJDQ-23	0.1590	0.1567	1.32
	0.1561
	0.1550
QJDQ-24	0.2554	0.2527	0.93
	0.2516
	0.2511
QJDQ-25	0.3130	0.3094	1.92
	0.3126
	0.3025

2.3 小结

本实验建立了拳卷地钱中芹菜素含量的测定方法，该方法稳定、简便、快速。实验色谱条件为：色谱柱：UltimatRXB-C₁₈（4.6×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.4％磷酸水溶液（34:66）；进样量：10 µL；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm；柱温：25 ℃。芹菜素溶液浓度在0.0041~0.0246 mg/mL线性关系良好，平均加样回收率101.09%；测得贺州市昭平等25个产地拳卷地钱药材的芹菜素含量在0.0344~0.7572 mg/g范围内，本品按干燥品计算，拟定芹菜素不得少于0.0275 mg/g。
3 总结与讨论
课题组的前期研究表明拳卷地钱护肝作用的药效物质基础是其总黄酮^[6]，芹菜素是总黄酮中的主要黄酮类成分且研究发现拳卷地钱总黄酮是以芹菜素为母核的黄酮类成分。因此，本文采用超声提取法，运用UV测定拳卷地钱总黄酮含量时以芹菜素为对照品。本实验以1%三乙胺-80%乙醇溶液显色，芹菜素作为对照品，测得这25个产地的拳卷地钱总黄酮含量范围为4.6822~26.3007 mg/g，用高效液相色谱法（HPLC）测定广西境内不同产地的25批拳卷地钱药材中芹菜素的含量范围是0.0344 ~0.7572 mg/g。通过芹菜素和总黄酮的含量测定，对广西产拳卷地钱的质量进行评价研究。通过测定结果可知贺州昭平县产拳卷地钱总黄酮及芹菜素含量最高，本研究拟定贺州昭平产拳卷地钱为后续产品开发研究的样品。
不同产地拳卷地钱总黄酮、芹菜素含量有显著差异，出现这种含量差异的原因可能是拳卷地钱产地的海拔、温度、湿度、降雨量等生长环境的因素的不同造成^[7]。贺州昭平等25个产地的拳卷地钱药材均是在2018年5月中旬至6月初采集，采集期间广西大部地区气温偏低、降雨量偏多，光照强度相对偏小，环境气候符合拳卷地钱的生长要求，故其代谢合成性能较高，其中主要化学成分含量也相对较高。研究不同产地拳卷地钱总黄酮和芹菜素的含量，对比其含量差异作为评价不同产地药材质量的依据，从而筛选出拳卷地钱的优质产地，为控制广西产拳卷地钱的质量以及为今后拳卷地钱产品开发提供参考依据，对拳卷地钱资源的利用具有重要指导意义^[⁸^]。

参考文献：
[1] 朱华.广西地钱属药用植物资源调查和形态构造研究[A].中国中医药学会编,第7届全国中药标本馆专业学术讨论会论文集[C].成都:成都中医药大学,2002,161-165
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[3] 朱华,邹登峰,黄海滨,等.拳卷地钱中芹菜素的测定[J]. 化工技术与开发,2005,(02):30-32+43.
[4] 王跃峰,杜沛霖,朱华,等.广西产拳卷地钱资源调查研究[J].大众科技,2017,19(09):12-13+26.
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[6]朱华,韦松基主编. 常用壮药生药学质量标准研究[M].南宁：广西民族出版社,2003:65-66.
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