金桔精油对小鼠精子功能及睾丸结构的影响

许立拔，宋莎娜，蒋伟哲^*，付书婕^*

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）
[摘要] 目的 研究金桔精油（KEO）对小鼠精子功能及睾丸结构的影响及停药后可恢复性。方法 KEO（2.0、1.0、0.5 g/kg），灌胃给药24天，停药恢复28天。给药结束（Day24）每组剖杀10只，其余小鼠恢复期结束（Day52）剖杀。检测精子活力、活率、密度和畸形率、血清、组织睾丸酮（T）水平和睾丸结构病理性改变。结果 与空白组比较，KEO各剂量组精子活力、活率及密度均显著降低（P<0.01），但畸形率无明显差异（P＞0.05）；day24，KEO 2.0、1.0 g/kg剂量组血清和睾丸T水平显著降低(P<0.01)，可见各组曲细精管均有不同程度的损伤，但day52，KEO各剂量组血清和睾丸T水平无明显差异（P＞0.05），曲细精管的病理改变明显改善。结论 首次发现金桔精油可导致精子功能和睾丸结构损伤，停药具有可恢复性，但无精子致突变性。
[关键词] 金桔精油;精子功能;睾丸结构;睾丸酮
Effects of kumquat essential oil on sperm functions and
testis structura in mice
XU Li-ba, SONG Sha-na, JIANG Wei-zhe^*, FU Shu-jie ^*
（Department of Pharmacology , Guangxi Medical University, Nanning 530021, China）
[Abstract] Objective To investigate effects of kumquat essential oil (KEO) on sperm function and testis structura in male mice, and the possibility of functional recovery after withdrawing. Methods The mice were administered KEO (2.0, 1.0, 0.5 g/kg) orally for 24 days, and recovery for 28 days. On Day24, 10 mice of each group were sacrificed, the remaining mice were sacrificed on Day52. The sperm motility, sperm living rate, sperm density and sperm abnormality rate were counted, the levels of testosterone (T) in serum and testis, and histopathological changes of testicular structure were determined. Results Compared with control group, the sperm motility, sperm living rates and sperm density in KEO groups were significantly decreased on both Day24 and Day52 (P<0.01), but the sperm abnormality rates were not significantly changed (P＞0.05); the levels of T in serum and testis in KEO 2.0, 1.0 g/kg groups were significantly decreased on Day24 (P<0.01), but there were not significantly changed on Day52 (P＞0.05); some pathological damages in seminiferous tubules were observed in KEO groups on Day24, but the pathological damages in seminiferous tubules were significantly relieved in KEO groups on Day52. Conclusions For the first time, we found that KEO could lead to decreasing of sperm function, pathological damages of testicular structure and had functional recovery after withdrawing, but no mutagenic effect on spermatozoa.
[Key words] kumquat essential oil; sperm function; testicular structure; testosterone
 
金桔属于柑橘类水果，洗干净后可以直接嚼食，外果皮、花朵及叶片均提取精油，外皮精油含有量最高，约为0.5%～2%^[1-2]，有研究表明，柠檬烯占金桔精油总精油量的93%^[3]。本研究使用的金桔精油，经前期GC-MS检测，主要有7种成分：D-柠檬烯、β-月桂烯、β-古巴烯、α-蒎烯、γ-榄香烯、β-水芹烯、乙酸香叶酯，D-柠檬烯含有量为95.62%，低毒^[4]。D-柠檬烯是金桔精油的最主要有效成分，已有研究表明，口服D-柠檬烯对食源性病原菌特别是小肠结肠炎耶尔森菌有明显抑制作用^[5]，有调节脂质代谢的作用^[6,7]；目前柠檬烯制剂有柠檬烯胶囊，具有松弛Oddi括约肌和降低胆压的作用，可治疗胆囊炎、胆管炎、胆结石^[8]。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）认为D-柠檬烯仅对成年雄性大鼠具有致癌作用，无基因、免疫及生殖毒性^[9]。预实验研究结果表明，金桔精油可降低精子活力、活率、密度，但存在一定的睾丸组织损伤。男性长期摄入有害物质会导致精子质量降低，损害生育能力，全球患有不育症的育龄夫妇为15%以上，其中男性不明原因不育约占50%^[10]。金桔精油是否有避孕作用及其病理性损伤是否具有可逆性，目前尚不明确，本实验以小鼠为研究对象，采用经口灌胃给药，研究金桔精油潜在的精子功能及睾丸结构损伤及停药后可恢复性，为金桔精油进一步研究和临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物  
SPF级雄性昆明种（KM）小鼠，体质量（40±4）g，80只，未育，由广西医科大学实验动物中心提供和饲养，环境符合SPF级要求，生产许可证号：SCXK桂2014-0002，动物使用许可证证号：SCXK桂2014-0003，质量合格证号：45000300000689。适应性饲养3天后，随机分组，进行药物处理。
1.2 试剂  
金桔精油（Kumquat essential oil，KEO），由广西医科大学药学院制剂实验室提供，D-柠檬烯含量为95.62%，1 mL金桔精油为0.851g；橄榄油，Olivoilà特级初榨，批号：20151021；BCA蛋白定量试剂盒，赛默飞世尔科技有限公司，批号：RF234184；睾酮（T）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20170313。
 
基金项目：科技部-中央引导地方科技发展专项资金项目（YDZX20174500003851）；南宁市青秀区科学研究与技术开发计划项目（2015G03）
作者简介：许立拔，男，在读硕士研究生，助理工程师，研究方向：新药研究开发，Tel:15078772841，E-mail: 349756009@qq.com作者单位：530021  南宁，广西医科大学药学院（许立拔，蒋伟哲，付书婕）
^*通讯作者：蒋伟哲，男，教授，研究方向：新药研究开发，Tel:13607713097，E-mail: jiangweizhe6812@163.com；
付书婕，女，讲师，研究方向：中药民族药研究与开发，Tel:13457076397，E-mail: fsj99331785@126.com
1.3 仪器
KF10002型电子天平，凯丰集团有限公司，感量：10 mg；EL-204型分析天平，德国梅特勒-托利多公司，感量：1 mg；CX31型生物显微镜，日本奥林巴斯公司；MKMo CL17R型高速低温离心机、MULTISKAN MK3型酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；FJ-200型高速分散均质机，上海标本模型厂。
1.4 分组及给药  
金桔精油设3个剂量组（2.0、1.0、0.5 g/kg），空白组（橄榄油）。80只雄性小鼠按体质量随机分为4组，每组20只。空白组按10 ml/kg给药体积给予橄榄油，金桔精油组按10 ml/kg给药体积给予不同浓度的金桔精油橄榄油药液，每天1次，连续给药24 d，恢复期28天。
1.5 采血  
于给药24 d及恢复期结束，提前禁食不禁水12~16 h，每组各取小鼠10只，拔眼采血，3000 r/min离心10 min，分离血清-20 ℃保存备用。
1.6 精子活力及精子活率^[11]
处死小鼠，分离睾丸、附睾，称重，取左侧附睾于2 ml生理盐水中，剪碎，吹打均匀，置于恒温水浴锅37 ℃孵育10 min。取精子悬液稀释20倍，用血球计数板连续计数200个精子的活动状态。将精子运动分为4级：Ⅰ级为快速、直线地向前运动；Ⅱ级为慢速或迟钝地直线或非直线向前运动；Ⅲ级为不向前运动；Ⅳ级为不活动。精子活力=100%×（Ⅰ+Ⅱ）/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）；精子活率=100%×（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）。
1.7 精子密度及精子畸形率^[12,13]
取精子悬液稀释20倍，用血球计数板计数精子数；取精子悬液涂片，干燥，甲醇固定5 min，1%伊红染色0.5 h，检查精子形态，每只小鼠检查1000个结构完整的精子，统计畸形精子类型及个数，计算精子畸形率。精子密度（×10⁸/g）=10000×20×2×(4大格细胞总数/ 4) /(附睾重量×10⁸)；精子畸形率=100%×各组畸形精子（总）数/1000。
1.8 睾丸组织的匀浆^[14]
取左侧睾丸，按重量：体积=1：9加入冰冻生理盐水，使用高速分散均质机制成组织匀浆，4℃，3000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法按试剂盒方法测定蛋白浓度。
1.9 血清和睾丸T的检测
采用ELISA法按试剂盒说明书测定血清和睾丸T水平。血清T水平直接测出，睾丸T（(nmol/g prot)）=样品睾酮浓度(nmol/L)/ 待测样本蛋白浓度(g prot/L)。
1.10 组织病理学检查  取右侧睾丸用Bouin’s液固定，附睾用10%中性福尔马林固定，苏木素-伊红（HE）染色，光镜检查。
1.11 统计学分析  采用SPSS17.0分析数据，实验数据采用±s表示，以P<0.05为有统计学意义。实验数据符合正态分布和方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD test分析；不符合正态分布和/或方差齐性的数据，组间比较采用Kruskal-Wallis H分析，两组间比较采用Mann-Whitney U分析。
2 结果
2.1 体质量  与空白组比较，给药前体质量无明显差异（P＞0.05），给药24天后，1.0、2.0 g/kg剂量组小鼠体质量显著降低（P＜0.05或P<0.01），恢复期结束，2.0 mg/kg剂量组小鼠体质量显著降低（P＜0.05），说明金桔精油大剂量服用会导致小鼠体质量减轻，但未见明显剂量相关性，且停药后具有可恢复性（表1）。
表1 金桔精油对雄性小鼠体质量的影响（n=10~20）
Tab.1 Effects of Kumquat essential oil on bodyweight of male mice (n=10~20)

注：与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，±s
^*P＜0.05, ^**P＜0.01, compared with control group, ±s
2.2 精子活力及精子活率  与空白组比较，给药24天后，金桔精油各剂量组小鼠精子活力及精子活率均显著降低（P<0.01），其中2.0 mg/kg剂量组小鼠精子活力为0，精子活率的减少具有剂量相关性，恢复期结束，金桔精油各剂量组小鼠精子活力及精子活率有所增加，但均显著低于空白组（P＜0.01），说明金桔精油长期大剂量服用会导致小鼠精子活力及精子活率降低，恢复正常的期限大于28天（表2）。
表2 金桔精油对雄性小鼠附睾精子活力及精子活率的影响
Tab.2 Effects of Kumquat essential oil on epididymal sperm motility and live sperm rate of male mice

注：与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，±s，n=10
^*P＜0.05, ^**P＜0.01, compared with control group, ±s，n=10
2.3 精子密度及精子畸形率  与空白组比较，给药24天后，金桔精油各剂量组小鼠精子密度均显著降低（P<0.01），存在剂量相关性，恢复期结束，金桔精油各剂量组小鼠精子密度有所增加，但均显著低于空白组（P＜0.01）；实验期间，与空白组比较，各剂量组精子畸形率无明显差异（P＞0.05），精子畸形的类型主要有不定形、无钩、香蕉、胖头、双头，但未发现特定类型精子畸形率有明显差异。说明金桔精油大剂量服用会导致小鼠精子密度降低，恢复正常的期限大于28天，未观察到金桔精油有生殖细胞致突变作用（表3）。
表3 金桔精油对雄性小鼠附睾精子密度及精子畸形率的影响
Tab.3 Effects of Kumquat essential oil on epididymal sperm density and sperm abnormality rate of male mice

注：与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，±s，n=10
^*P＜0.05, ^**P＜0.01, compared with control group, ±s，n=10
2.4 血清和睾丸T水平  与空白组比较，给药24天后，金桔精油1.0、2.0 g/kg剂量组小鼠血清和睾丸睾酮水平均显著降低（P<0.01），其中睾丸睾酮水平存在剂量相关性，恢复期结束，金桔精油各剂量组小鼠血清和睾丸睾酮水平未见明显差异（P＞0.05），说明金桔精油大剂量服用会导致小鼠血清和睾丸睾酮水平降低，但具有可恢复性，停药28天可恢复正常（表4）。
表4 金桔精油对雄性小鼠血清及睾丸睾酮水平的影响
Tab.4 Effects of Kumquat essential oil on serum and testis testosterone of male mice

注：与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，±s，n=10
^*P＜0.05, ^**P＜0.01, compared with control group, ±s，n=10
2.5 睾丸病理结构改变  给药24天后，空白组睾丸曲细精管生精上皮呈规则圆形，各级生精细胞排列规则，结构清晰，发育良好。而金桔精油各剂量组睾丸曲细精管均有不同程度损伤。0.5 g/kg剂量组曲细精管有轻度萎缩，部分管腔偏位呈不规则椭圆形；1.0 g/kg剂量组曲细精管明显萎缩，大部分管腔偏位呈不规则椭圆形，曲细精管腔中脱落细胞增多；2.0 g/kg剂量组曲细精管明显萎缩，大部分管腔偏位呈不规则椭圆形，界限模糊不清，细胞层次明显减少，各级生精细胞排列紊乱，数量明显减少。恢复期28天结束后，空白组和0.5 g/kg剂量组睾丸曲细精管未见明显病理性改变，睾丸曲细精管生精上皮饱满而厚，层次分明，发育良好。1.0、2.0 g/kg剂量组曲细精管仍有轻度萎缩，仍有部分睾丸生精小管上皮管腔偏位，呈不规则椭圆形，但大部分睾丸生精小管上皮管腔规则圆形，各级生精细胞排列规则，结构清晰，层次分明，界限清晰（图1）。
 
A.空白组；B.金桔精油0.5 g/kg组；
C. 金桔精油1.0 g/kg组；D. 金桔精油2.0 g/kg组
图1 金桔精油对雄性小鼠睾丸组织改变HE染色图（HE，100×）
Fig. 1 Effects of Kumquat essential oil on testis structural change of male mice by HE staining (HE, 100×)
3 讨论
有很多研究表明，化学物质及物理因素均可引起精液质量下降，精子数量减少，可致男性不育^[15]。棉酚作为男性避孕药，效果显著，但其毒副作用低血钾症和不可逆性不育，限制了其在临床上的使用^[16]。目前，临床上常用的男性避孕药是雄性激素类药物，长期使用激素会引起很多机体不良反应，其前景尚不可知。寻找既能有效避孕，副作用少，且又具有病理损伤可逆性的药物，是男性避孕药开发的关键。
精子功能，包括精子活力和活精子数目，是男性生育能力的重要影响因素^[17]，精子功能减弱是反映男性生殖功能异常的早期指标，主要表现为男性精子密度及质量降低，无精、少精和弱精。精子畸形率升高，涉及多个染色体基因和性连锁基因发生突变，反映男性生殖细胞的遗传损伤^[18]。本文结果表明，金桔精油0.5 g/kg及以上剂量组给药24天及恢复期28天结束，精子活力、精子活率、精子密度均低于空白组，说明金桔精油具有杀精及降低精子功能的作用，具有开发为男性避孕药的前景，且未观察到精子特定类型精子畸形率和总精子畸形率的变化，说明金桔精油无生殖细胞致突变性，致癌及致遗传损伤、胎仔畸形的风险较低。
睾丸的主要功能是生精和分泌雄性激素睾酮，曲细精管是睾丸的主要结构，负责生成未成熟的精子^[13]。本文病理观察表明，金桔精油可导致曲细精管萎缩、变性，生精细胞数量减少、缺失，存在一定的睾丸病理损伤，导致睾酮分泌量减少，停药恢复28天病理改变有所改善，仍不能恢复正常，但睾酮分泌量可恢复正常。说明睾丸结构改变及抑制雄性激素分泌，可能是金桔精油作为男性避孕药的重要机制，但停药后具有可恢复性，且雄性激素分泌量恢复较快，对男性性功能不会造成不可逆性损伤。
金桔精油是柑橘类水果金桔的提取物，属于低毒物质^[4]，可降低精子功能和精子密度，改变睾丸结构，能减少小鼠睾丸精子和睾酮的产生及降低精子功能，无致畸致突变性，且副作用较少，体重减轻可能是副作用之一，但具有可恢复性。故认为，金桔精油具有开发为男性避孕药的前景。
 
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