广西壮瑶药重点实验室、壮瑶药协同创新中心

目的：为落实广西壮族自治区食品药品监督管理局项目“响应面法优化瑶药材小驳骨总酚酸及总黄酮的提取工艺及质量标准研究[(2023)033号]”和“国家药典委员会国家药品标准制修订项目(BZ2022134)”，本研究以《广西壮族自治区瑶药材质量标准第一卷》中的瑶药材小驳骨（Gendarussa Herba）为研究对象，在原有质量标准的基础上，进一步对药材进行鉴别、限量检查、总黄酮和总酚酸含量测定、化学成分测定及药效活性研究，完善小驳骨质量评价体系，为小驳骨开发利用提供科学依据。

方法：1. 按照《中华人民共和国药典》2020年版第四部规定的方法，对小驳骨进行性状鉴别、显微鉴别及薄层色谱鉴别，对水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、重金属及有机氯农药残留等进行限量检查。2. 采用响应面曲线法探究小驳骨中总黄酮、总酚酸的最佳提取工艺，利用紫外分光光度法、测定24个不同产地小驳骨样品的总黄酮及总酚酸含量。3. 采用UPLC-MS/MS技术分析小驳骨醇提取物；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；流动相：A 0.1% 甲酸水溶液，B 0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，探讨小驳骨化学成分。4. 单次给药毒性试验：给药后分别对各剂量组进行14 d一般症状观察，记录体重、小鼠存活数目，以加权回归（Bliss）法测定半数致死数量（LD₅₀）、剖检进行大体病理学检查；重复给药毒性试验：连续各剂量组灌胃14 d。每天观察一般临床症状一次，测定体重及进食量，给药结束后采血测定肝功能指标，观察主要脏器的组织病变情况、计算脏器系数、及组织病理学检查。5. 建立脓毒症模型成功后，连续检测大鼠的肛温并计算肛温变化值，记录24 h内大鼠死亡数目，造模24 h后，麻醉，腹主动脉采血，血清指标ELISA检测，脏器指数检测、肺组织湿干重比（W/D）检测、苏木素-伊红染色（HE染色）检测组织病理学改变、实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测肺组织TLR4和NF-κB p65 mRNA表达水平、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα和p-IκBα检测、免疫组化法检测肺、肝和下丘脑NF-κB p65原位蛋白表达，探讨小驳骨水提物对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的脓毒症(sepsis)大鼠组织器官保护的作用。

结果：1. 瑶药材小驳骨叶、嫩茎横切片、叶表面片和粉末鉴别特征中，钟乳体椭圆形或长方形；腺鳞多见，头部4细胞，柄单细胞；石细胞众多，分层明显；薄壁细胞含草酸钙方晶，与《中国药典》描述小驳骨的显微鉴别特征一致。薄层鉴别项，斑点清晰，分离效果好，在与对照药材色谱相应的位置上，24个产地的小驳骨供试液显相同颜色的荧光斑点。

2. 24个不同产地瑶药材小驳骨的水分在2.90%~9.33%之间，均小于10%；总灰分含量在9.29%~10.97%之间；酸不溶性灰分含量在0.53%~1.97%之间；水溶性浸出物含量在12.17%~29.69%之间；醇溶性浸出物含量在12.79%~22.73%之间，均符合《中国药典》2020 年版规定。18个批次小驳骨药材中铅（0.188~2.86 mg/kg）、镉含量（0.00~0.0467 mg/kg）、总砷（0.00~0.233 mg/kg）、铜（2.62~5.12 mg/kg）、汞（0.000~0.0431 mg/kg）；（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、总滴滴涕（pp'-DDE、pp'-DDD、op'-DDT、pp'-DDT）、总六六六（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）和五氯硝基苯9种有机氯均未检出。综合5种重金属与9种有机氯农药残留结果，建议按照《中国药典》统一的指标，增加小驳骨检查项目中重金属限量的检测。

3. 响应面法优化了瑶药材小驳骨总黄酮和总酚酸的提取工艺。验证结果表明小驳骨总黄酮最佳提取工艺为料液比为1:30、温度为60 ℃、时间为45 min、乙醇浓度为70%；小驳骨总酚酸的最佳提取工艺为乙料液比1:20、温度为55 ℃、时间为40 min、乙醇浓度为70%。各样品采集地之间存在一定的含量差异，总黄酮含量最高的产地为广西柳州柳东区（S-24），为4.241 mg/g，最低的为广东茂名市电白区沙琅镇（S-10），为1.635 mg/g，总酚酸含量最高的产地为广西宾阳县（S-22），为11.860 mg/g，最低的为广东茂名市电白区沙琅镇（S-10），为3.465 mg/g。

4. 鉴定出小驳骨化学成分60个，其中生物碱类化合物16个，黄酮类成分10个，萜类化合物5个，苯丙素类化合物5个，酚酸类物质3个，香豆素类化合物2个，其他化合物19个，为小驳骨化学成分的分离和鉴定及药效物质提供了实验基础。

5. 急性毒性预实验确定正式实验的最高剂量（LD₁₀₀）为339.2 g/kg，最小剂量（LD₀）为169.6 g/kg，单次灌胃不同浓度给药，一般临床观察结果显示，潜在毒性作用系统为中枢神经系统、呼吸系统和消化系统，半数致死量LD₅₀=274.805 g/kg；重复14 d给药，一般临床观察未观察到明显的毒性症状改变，无死亡。给药14 d期间，小驳骨水提物169.6 g/kg及以下剂量对小鼠体重、体重增长、重料比、脏器重量和脏器指数均无明显影响，但肝、肾功能指标ALT、AST、BUN和Cr水平均升高，肝、肾发生明显的组织病理结构改变，如肝索细胞排列紊乱、肝组织水肿、肝组织点状坏死、肾小球萎缩、伴随肾小球系膜细胞不同程度减少、瘀血和肾小管上皮细胞空泡化等。小驳骨水提物被证实确实存在一定毒性，且存在明显的剂量-毒性效应关系，主要潜在的毒性靶向器官有肝、肾。

6. 小驳骨水提物可降低LPS诱导的脓毒症症状，可降低大鼠肛温，增加大鼠存活率、升高血清SOD水平，降低肺、肝指数、肺组织湿干重比、血清MDA、ALT、AST、IL-6、IL-1β和TNF-α等水平，降低肺组织IL-6、IL-1β和TNF-α水平，明显改善肺组织和肝组织病理学结构和形态，NF-κB p65原位蛋白表达程度均降低。

结论：本研究在原有的质量标准上进一步梳理，在茎、叶横切片显微鉴别中发现小驳骨的上下表皮细胞中含有较多的钟乳体，腺鳞，可将其作为茎、叶横切片的主要鉴别特征；增加了对小驳骨农药残留量、重金属含量、有关毒性成分的测定分析，进行了小驳骨水提物的急性毒性研究，可为其制定安全性评价指标及临床安全剂量提供参考依据；响应面法优化小驳骨总黄酮、总酚酸提取工艺的方法可行；初次利用液质联用技术分析小驳骨化学成分，总体分类以生物碱类、黄酮类为主；初步探讨小驳骨水提物对LPS诱导的大鼠脓毒症组织器官的保护作用，发现其具有良好的组织器官保护作用，与抑制NF-κB信号通路密切相关，本研究以小驳骨药材鉴别、检查、安全性评价为基础，对小驳骨进行总黄酮、总酚酸含量测定、化学成分鉴定及药理机制研究，为瑶药材小驳骨质量标准评价体系进一步完善提供实验依据。