一、开机程序

1.检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。

2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液捅中加人400m1漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液捅，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFIow)，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3.将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY, 预热5一10分钟。排出过滤器内的气泡。

4.如果需要打印，打开打印机电源。

5.打开电脑，等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6.执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。

7.分析样品时，先用FACAFIow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。做过分选后，每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50m1离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

二、预设获取模式文件(Acquisition Template Files)

1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。

3.选取屏幕左列绘图工其中的Histogram ,同上法可绘出Histogram(直方图)。

4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。

三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整

1.从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。

2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。

3.从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps,  Threshold.  Compensation.  Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1, 2, 3, 4获得此四个对话框。

4.在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式((amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2,而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量;分析细胞DNA含量时，FSC,  SSC,  FL1,  FL2, FL3皆以

Lin进行测量，且DDM Param选择FL2;分析血小板表型时，FSC, SSC, FL1, FL2, FL3等均以Log进行测量。

5.放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上。

 6.在Acquisiton Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,  Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。

7.在Detectors /Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMT voltages(粗调)与Amp Gains(细调)，使样品信号出现在FSC-SSC点图内，且三群细胞合理分布。

 8.在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低，以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC一H而做DNA时用FL2一H。 Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。

9.从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域)，并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。

10.在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器( FLl, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。

11.在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。

比如应该为FLl+ FL2一的细胞群却分布在FLl+ FL2+区域内，则需调大FL2-? %FLl中的“?”，并从FLl-FL2点图中观察新的调整是否恰当。

12.在Status对话框中可见:Laser Power:正常值Run/Ready为14.7mW,  Standby为5mW;  Laser current;正常值为6Amps左右。

13.调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。

四、通过预设的获取模式文件进行样品分析

1.从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。

2.从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。

3.从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set确定。

4.在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。

5. 在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tubel, 2, 3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于LSRFortessa\BD Applications \CELLQuest \IMM和DNA文件夹中。文件根据日期命名。

6.在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。

7.将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。

8.微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort，去除Setup前的“”，开始正式获取信号，存储数据。

9.当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7,继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。

注意: 当所有样品分析分析完毕，.即换上三蒸水。并将流式细胞仪置于"STANDBY”状态, .以保护激光管。

五、关机程序:

1.从File中选择Quit，退出软件，选择Don' tSave至苹果屏幕。

2.用4m1 1: 10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位(vacuum is on )，以外管吸去约2m1，在将样品架置于中位(vacuum is off )，再HIGH RUN 5分钟(内管吸去2m1)。

3.改用三蒸水4ml作样品，同上处理。

4.按Prime三次。

5.此时仪器自动转为STANDBY状态，换2m1三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。

6.填写使用登记表

★注意事项

1.每日保养

 (1)用4m110 %漂白剂作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入2m1。

 (2)将样品支撑架置于中位，以HI RUN 5分钟，使内管吸入2m1。

 (3)将样品换成蒸馏水重复1-2步。

 (4)放置盛有lml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

 (5)选择Standby模式10分钟。

 (6)关闭电脑，再关掉仪器。

2.每月保养

 (1)将10%漂白剂装入鞘液桶。

 (2)旁路鞘液过滤器，以防损害。

 (3)将盛有3m110 %漂白剂的试管置于样品支架上，以HI RUN 20-30分钟。

（4）将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤(3)